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    NEB/Q5??Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells)/E0552S/10 reactions
    • NEB/Q5??Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells)/E0552S/10 reactions

    NEB/Q5??Site-Directed Mutagenesis Kit (Without Competent Cells)/E0552S/10 reactions

    價格: ￥1572.00 市場價: 2620.00
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    貨號: E0552S-10reactions
    品牌: NEB
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      • Description:

        TheQ5Site-DirectedMutagenesisKit(WithoutCompetentCells)enablesrapid,site-specificmutagenesisofdouble-strandedplasmidDNAinlessthan2hours(Figure1).ThekitutilizestherobustQ5HotStartHigh-FidelityDNAPolymerasealongwithcustommutagenicprimerstocreateinsertions,deletionsandsubstitutionsinawidevarietyofplasmids.AfterPCR,theamplifiedmaterialisaddeddirectlytoauniqueKinase-Ligase-DpnI(KLD)enzymemixforrapid(5minutes),roomtemperaturecircularizationandtemplateremoval(Figure2).Transformationintohigh-efficiencychemically-competentE.coli,notsupplied,ensuresrobustresultswithplasmidsuptoatleast20kbinlength.

        Figure1:Site-specificmutagenesisproceedsinlessthan2hours.Figure 1: Site-specific mutagenesis proceeds in less than 2 hours.

        Theuseofamastermix,auniquemulti-enzymeKLDenzymemix,andafastpolymeraseensuresthat,formost?plasmids,themutagenesisreactioniscompleteinlessthantwohours.
        ???
        Figure2:Q5Site-DirectedMutagenesisOverview.Figure 2: Q5 Site-Directed Mutagenesis Overview.

        Thiskitisdesignedforrapidandefficientincorporationofinsertions,deletionsandsubstitutionsintodoublestranded?plasmidDNA.Thefirststepisanexponentialamplificationusingstandardprimersandamastermix?fomulationofQ5HotStartHigh-FidelityDNAPolymerase.Thesecondstepinvolvesincubationwithaunique?enzymemixcontainingakinase,aligaseandDpnI.Together,theseenzymesallowforrapidcircularizationofthe?PCRproductandremovalofthetemplateDNA.Thelaststepisahigh-efficiencytransformationintochemicallycompetent?cells(notprovided).
        Figure3:PrimerDesignforQ5Site-DirectedMutagenesisFigure 3: Primer Design for Q5 Site-Directed Mutagenesis

        Substitutions,deletionsandinsertionsareincorporatedintoplasmidDNAthroughtheuseofspecificallydesigned?forward(black)andreverse(red)primers.Unlikekitsthatrelyonlinearamplification,primersdesigned?fortheQ5Site-DirectedMutagenesisKitshouldnotoverlaptoensurethatthebenefitsof?exponentialamplificationarerealized.A)Substitutionsarecreatedbyincorporatingthedesirednucleotide?change(s)(denotedby*)inthecenteroftheforwardprimer,includingatleast10complementarynucleotideson?the3′sideofthemutation(s).Thereverseprimerisdesignedsothatthe5′endsofthetwoprimersannealbackto-back.B)Deletionsareengineeredbydesigningstandard,non-mutagenicforwardandreverseprimersthatflank?theregiontobedeleted.C)Insertionslessthanorequalto6nucleotidesareincorporatedintothe5′endofthe?forwardprimerwhilethereverseprimerannealsback-to-backwiththe5′endofthecomplementaryregionofthe?forwardprimer.D)Largerinsertionscanbecreatedbyincorporatinghalfofthedesiredinsertionintothe5′ends?ofbothprimers.Themaximumsizeoftheinsertionislargelydictatedbyoligonucleotidesynthesislimitations.
        Figure4:NEB’sQ5SDMKitdelivershighertransformationefficiencythanAgilent’sQuikChange?SDMKit
        Q5 Graph
        Resultsfromasubstitutionreaction(4nt)usingtheback-to-backControlSDMPrimerMixandControlSDMPlasmid(6.7kb)areshown,alongwithresultsfroma12ntdeletionexperiment(5.8kbplasmid)andan18ntinsertionexperiment(7.0kbplasmid).Inallthreecases,over90%oftheresultantcolonieshadincorporatedthedesiredmutation(s).Resultsarenormalizedtototaltransformantsifcellswerenotdilutedpriortoplating.Forcomparison,thesamesubstitutionreaction(4nt)wasperformedwiththeQuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesisKit(Agilent)followingAgilent’sprotocolandusingAgilent’sprimerdesigntooltodesignoverlappingprimers.

        *NotethattheQuikChangekitdoesnotaccommodatedeletionsandinsertionsofthissize,sonocomparisoncouldbemadefortheseexperiments.

        KitComponents

        Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:

        Storeat(°C)Concentration
        Q5®HotStartHigh-Fidelity2XMasterMix-202X
        KLDEnzymeMix-2010X
        KLDReactionBuffer-202X
        ControlSDMPrimerMix-2010μM
        ControlSDMPlasmid-205μg/ml

        Notes:

        StorageNote:TheQ5Site-DirectedMutagenesisKit(WithoutCompetentCells)isstableat–20°Cfortwoyears.Forflexibility,themutagenesisreagentsandcontrolreactionsaresuppliedwithoutcompetentcellssothatanychemically-competentE.colicellssuitableforcloningmaybeused.
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