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    NEB/NEBuilder? HiFi DNA Assembly Master Mix/E2621S/50 reactions
    • NEB/NEBuilder? HiFi DNA Assembly Master Mix/E2621S/50 reactions

    NEB/NEBuilder? HiFi DNA Assembly Master Mix/E2621S/50 reactions

    價格: ￥7560.00 市場價: 12600.00
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    貨號: E2621S-50reactions
    品牌: NEB
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      • Description:






        NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMixwasdevelopedtoimprovetheefficiencyandaccuracyofDNAassembly.ThismethodallowsforseamlessassemblyofmultipleDNAfragments,regardlessoffragmentlengthorendcompatibility.Thismethodhasbeenusedtoassembleeithersingle-strandedoligonucleotidesordifferentsizesofDNAfragmentswithvariedoverlaps(15–80bp).IthasutilityforthesyntheticBIOLOGycommunity,aswellasthoseinterestedinone-stepcloningofmultiplefragmentsduetoitseaseofuse,flexibilityandsimplemaster-mixformat.Thereactionincludesdifferentenzymesthatworktogetherinthesamebuffer(seeFigure1):
        • Theexonucleasecreatessingle-stranded3′overhangsthatfacilitatetheannealingoffragmentsthatsharecomplementarityatoneend(theoverlapregion)
        • Thepolymerasefillsingapswithineachannealedfragment
        • TheDNAligasesealsnicksintheassembledDNA?
        Theendresultisadouble-strandedfullysealedDNAmoleculethatcanserveastemplateforPCR,RCAoravarietyofothermolecularbiologyapplications,includingdirecttransformationofEcoli.

        NEBuilderHiFiDNAAssemblykitsareavailableinvariousformats:withNEB5-alphacompetentcells(CloningKit,NEB#E5520),asabundlewithNEB10-betacompetentcells(BundleforLargeFragments,NEB#E2623)andwithoutcompetentcells(MasterMix,NEB#E2621).NEB5-alphacompetentcellscellsareexcellentforroutineassembliesof15kborless.NEBrecommendsNEB10-betaCompetentE.coli(HighEfficiency,NEB#C3019)orNEB10-betaElectrocompetentE.coli(NEB#C3020)forassemblieslargerthan15kb.Iftheassembledgenescontainrepetitivesequences,NEBStableCompetentE.coli(NEB#C3040)shouldbeused.?

        NEBuilderhasbeenusedinvariousapplications,including:
        • Site-directedmutagenesis
        • ConstructionofansgRNA-Cas9expressionvector|Animation
        • Assemblyoflinearyeastexpressioncassettes
        TohelpselectthebestDNAassemblymethodforyourneeds,pleaseuseourSyntheticBiology/DNAAssemblySelectionChart.

        ForhelpdesigningyourprimersforusewithNEBuilder,pleaseviewourprimerdesignvideo.

        Figure1:OverviewoftheNEBuilderHiFiDNAAssemblyMethodFigure 1: Overview of the NEBuilder HiFi DNA Assembly Method

        Figure2:NEBuilderHiFiDNAAssemblyoffersimprovedefficiencyandaccuracyover
        NEBGibsonAssembly
        Reactionsweresetupina2-and6-fragmentassemblyreactionaccordingtorecommendedreactionconditions.NEBuilderHiFiDNAAssemblyresultsinlargernumbersofcoloniesoverNEBGibsonAssembly,forboth2-and6-fragmentassemblies.

        ViewadditionalperformancedatacomparedtoNEBGibsonAssembly
        Figure3:NEBuilderHiFidelivershighercolonyyieldthanIn-FusionHD
        Two-fragmentreactionsweresetupusingthepositivecontrolfromtheIn-FusionHDCloningKit(ClontechTakaraBioUSA,Inc),accordingtorecommendedprotocols.2μlofassemblyreactionwastransformedintosuppliedcompetentcells.1/50ofoutgrowthwasspreadonanApRplate.

        ViewadditionalperformancedatacomparedtoIn-FusionHD

        ?
        table iconComparisonofDNAAssemblyReactionTypes



        ?

        KitComponents

        Thefollowingreagentsaresuppliedwiththisproduct:

        Storeat(°C)Concentration
        NEBuilder?High-FidelityMasterMix-20
        NEBuilder?PositiveControl-202X

        Notes:

        ToensurethesuccessfulassemblyandsubsequenttransformationofassembledDNAs,NEBrecommendsthefollowing:DNA:PCRproductpurificationisnotnecessaryifthetotalvolumeofallPCRproductsis20%orlessoftheassemblyreactionvolume.HighervolumesofPCRproductsmayreducetheefficiencyofhigh-fidelityDNAassemblyandtransformationduetotheelevatedcarryoveramountsofPCRreactionbufferandunusedprimerspresentinthePCRproduct.ColumnpurificationofPCRproductsmayincreasetheefficiencyofbothhigh-fidelityDNAassemblyandtransformationby2–10foldandishighlyrecommendedwhenperformingassembliesofthreeormorePCRfragmentsorassemblinglongerthan5kbfragments.PurifiedDNAforassemblycanbedissolvedinddH2O(Milli-Q?waterorequivalentispreferable),TEorotherdilutionbuffers.Insert:Whendirectlyassemblingfragmentsintoacloningvector,theconcentrationofassemblyfragmentsshouldbeatleast2timeshigherthantheconcentrationofvector.Forassemblyof4ormorefragmentsintoavector,werecommendusinganequimolarratiooffragments.Transformation:NEB5-alphaCompetentE.coli(HighEfficiency,NEB#C2987)providedwiththeNEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKitarerecommendedforuseforassembledproductsoflessthan15kb.ItisalsopossIBLetouseotherNEBcompetentE.colistrains,withtheexceptionofBL21,BL21(DE3),Lemo21(DE3),Nico(DE3),andSHuffle?.WhenusingcompetentE.colifromavendorotherthanNEB,wehavebeendecreasedrobustnessoftransformationwithhigh-fidelityDNAassembledproducts.Electroporation:Electroporationcanincreasetransformationefficiencybyseverallogs.WhenusingtheNEBuilderHiFIDNAAssemblyMasterMix,use1μloftheassembledproductforelectroporation,andplatemultipledilutions.ShouldyourequiretheuseofElectrocompetentcells,pleaseusethe"ElectrocompetentCellsTransformationProtocol"Biology:SomeDNAstructures,includinginvertedandtandemrepeats,areselectedagainstbyE.coli.SomerecombinantproteinsarenotwelltoleratedbyE.coliandcanresultinpoortransformationorsmallcolonies.
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